北理工课题组开发BmoR传感器加速塑料降解酶定向进化
近日,北理工霍毅欣课题组在1区TOP期刊《Advanced Science》发表题为“Customization of Ethylene Glycol (EG)-Induced BmoR-Based Biosensor for the Directed Evolution of PET Degrading Enzymes”的研究文章。文章为PET降解酶的定向进化提供了基于BmoR生物传感器可视化高通量筛选工具,加快了酶元件“设计-构建-测试-学习”循环,对塑料废弃物的生物降解及回收利用具有重要意义。该工作以北京理工大学为第一通讯单位,硕士生李敏和陈振娅研究员为共同第一作者,陈振娅研究员和霍毅欣教授为共同通讯作者,山东大学祁庆生教授为共同作者。
来源于假单胞菌 (Pseudomonas butanovora) 的BmoR是一种σ54依赖型转录激活子,属于细菌增强子结合蛋白的成员。BmoR在正烷烃代谢途径中被发现和表征,可以识别并结合C2-C7的醇分子并增强下游基因的转录。本课题组已经在大肠杆菌中构建基于BmoR的生物传感器系统用于异丁醇高产菌株的高通量筛选,以及高效细胞工厂的动态调控。PET在塑料降解酶的生物降解作用下,水解产生中间体MHET,继续被水解产生乙二醇。乙二醇 (Ethylene glycol, EG) 和对苯二甲酸 (Terephthalic acid, TPA) 是组成PET高聚体的基本单元。EG作为一种潜在配体分子,有潜力活化BmoR并激活下游报告基因的转录。选择荧光蛋白作为报告蛋白,论文开发了一种基于BmoR传感系统的可视化高通量筛选体系(图1),为PET降解酶的定向进化提供宝贵工具。
图1 FACS协助的EG特异性响应BmoR突变体的筛选流程
塑料污染是当今环境面临的严重问题之一,开发具有高效降解能力的塑料降解酶可以为相关产业带来新的商机和发展机会。蛋白质的定向进化是一种利用分子生物学和进化算法相结合的技术,用于改变蛋白质的性质或功能,不需要对蛋白质的结构和功能之间的关系有深度理解。定向进化在较短的时间内能得到基因多样性的大量突变体文库,增加了筛选的广度和多样性,加速了酶改造升级的进程。通过定向进化的方法优化塑料降解酶的活性和特异性,可以提高塑料废物的回收和再利用效率。这有助于减少对新原料的需求,降低生产成本,推动可持续资源利用。然而,定向进化的瓶颈在于高通量筛选工具的开发。
TFB将基因型和表型耦连,能够将分子的浓度信号转化为可视化的光信号,允许研究者用酶标仪代替吞吐量低、成本高的液相、气相色谱技术。在单基因层面,TFBs可以对构建的不同尺度的基因文库进行筛选或挖掘,加快了酶元件改造和开发的进程。在基因组层面,TFB可以从大型菌株突变库中识别出具有所需表型或可高产出目标化合物的微生物菌株个体,加快了菌株选育的进程,以实现生物制造行业的有利可图的生物过程。BmoR是一种可受醇调节的转录因子,并调节Pbmo启动子驱动下游基因的表达。选择荧光蛋白作为报告信号置于启动子Pbmo下游,通过醇分子调节BmoR进而表达报告基因,可以将BmoR开发为可视化高通量筛选工具。论文利用已经定制的具有高动态范围、高灵敏度的EG响应型BmoRN207S传感系统,对以SUMO-MHETase-FASTase融合表达形式构建了MHETase随机突变文库。将传感系统和降解系统耦连,用于MHETase的定向进化,以提高催化活性(图2)。
图2 利用生物传感器筛选的高活性MHETase突变体
此项工作得到国家自然科学基金委国际合作项目“塑料解聚及资源化微生物菌群的人工构建”及面上项目、河北省自然科学基金委和唐山市科技计划项目的资助,以及北京理工大学生物与医学工程公共实验中心的支持。
北理工课题组在BmoR生物传感元件的改造与应用已发表多篇高水平文章,例如Advanced Science, 2024, 11: 23;Acs Sensors, 2024, 9:5002-5024; Chemical Engineering Journal, 2024, 491: 152076;Microbial Cell Factories, 2019, 18: 30;Metabolic Engineering, 2019, 56: 28-38;ACS Synthetic Biology, 2022, 11: 1251-1260。
原文链接: https://doi.org/10.1002/advs.202413205
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